01

 

　　PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤，這大多是由于聚合酶忠實性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會出現(xiàn)該問題，此時應制備新的濃度相同的dNTP混合物。

 

　　02

 

　　ABI7500熒光定量PCR儀目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題，則需要進行細致的分析，因為引起該問題的可能很多。可先檢查是否模板質(zhì)量問題，如有降解等，模板應避免反復凍融。也有可能是抽提RNA時有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴增引發(fā)該問題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起，則進一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴增的條件不合適。針對具體原因再采取相應的措施。

 

　　03

 

　　PCR產(chǎn)物何時需要用凝膠純化，何時不需要？當凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶時，則不需要使用凝膠純化。當可見其他雜帶時，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。

 

　　04

 

　　如果實驗中沒有回收到目的片段，則需要繼續(xù)進行對照實驗。包括涂布未轉化的感受態(tài)細胞、轉化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞，按照的實驗步驟進行。

 

　　05

 

　　實驗中出現(xiàn)假陽性擴增該怎么辦？這是擴增系統(tǒng)受到污染的表現(xiàn)，應通過檢查排除污染源。先考慮是否為試劑污染，可將試劑分裝好直接置于PCR儀中擴增進行判斷。其次要考慮是否為實驗室污染，可更換所用的移液器、吸咀管（離心管）等，將試驗中的關鍵步驟轉移到一個新的環(huán)境中，判斷是否為實驗室污染。如果是則需要對整個實驗室及實驗器材*清洗處理，保持良好的通風、清潔等。此外，還要考慮是否為采樣污染，一般表現(xiàn)為一批結果陽性率很高，一批結果陽性率又下降很多，如此反復。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣。

 

　　06

 

　　實驗中出現(xiàn)假陰性擴增該怎么辦？先要考慮是否為儀器故障，ABI7500熒光定量PCR儀儀器應正常運轉，尤其要注意加熱溫度及各管間的差異是否符合實驗要求，是否出現(xiàn)誤差等。其次要考慮是否為試劑失效或無效引起，使用有效的試劑。